·论著·

    基金项目:卫生部临床学科重点项目基金(20010409)

    作者单位:100041 北京,中国医学科学院中国协和医科大学整

    形外科医院(徐家杰、李森恺、李强、范巨峰、李养群) ;中国医学科学

    院中国协和医科大学基础所生化和分子生物学实验室(王艳萍、沈

    岩)

    责任作者:李森恺

    尿道下裂患者 SRD5A2 基因突变的研究

    徐家杰 李森恺 李强 范巨峰 王艳萍 李养群 沈岩

    【摘要】 目的 探讨 SRD5A2基因在尿道下裂发病中的作用。方法 收集 96 例先天性尿道下

    裂患者外周静脉血 ,提取DNA ,采用 PCR扩增直接测序的方法检测 SRD5A2 基因全部外显子序列。

    结果 96例中有14例发现了8种突变 ,5种错义突变 ,1 种同义突变 ,1 种无义突变 ,1 种移码突变。

    分别位于第1、 4、 5 外显子。其中 Gln6stop , His232His , Phe234Leu及移码突变没有报道过。结论 第

    4外显子是突变发生的热点区域 ,约1P 10尿道下裂患者存在不同程度的 SRD5A2基因结构异常。

    【关键词】 尿道下裂 SRD5A2基因 基因突变

    Mutation analysis of SRD5A2 gene in patients with hypospadias XU Jia2jie

    3

    ,LI Sen2kai ,LI Qiang , Fan

    Ju2 feng ,WANG Yan2ping ,LI Yang2qun , SHEN Yan.

    3

    Plastic Surgery Hospital , Peking Union Medical College ,Chinese Academy of Medical Sciences , Beijing 100041 , China

    【Abstract】 Objective To explore possible molecular mechanism of hypospadias and relationship of the

    mutation of SRD5A2 gene to hypospadias. Methods 96 blood samples from the patients with hypospadias were

    obtained and DNA was estracted from blood leukocytes. Polymerase chain reaction and direct sequencing were

    performed to analyze the coding regions of SRD5A2 gene. Results 8 mutations were detected from 14 cases ,including 5 missense mutations , 1 synonymous mutation , 1 nonsense mutation and 1 frameshift mutation. The

    mutations are in 1st , 4th and 5th exon. Gln6stop , His232His , Phe234Leu and frameshift mutations are novel .

    Conclusions Exon 4 is a hot spot region of mutation within SRD5A2 gene , and about 10 percent of hypospadiac

    patients complicated with SRD5A2 dysfunction or deficiency.

    【Key words】 Hypospadias ; SRD5A2 gene ; Gene mutation

    尿道下裂是一种常见的男性泌尿生殖系统的先

    天性畸形 ,其发病原因仍不清楚 ,有研究表明 ,胚胎

    期男性外生殖器的发育与雄激素(睾酮和双氢睾酮)

    水平密切相关 ,而双氢睾酮的生物学效应是睾酮的

    50倍 ,是诱导男性外生殖器发育的主要雄激素 ,5α

    还原酶是催化睾酮转化为双氢睾酮的关键酶 ,动物

    实验表明抑制类固醇5α还原酶 Ⅱ(SRD5A2)可导致

    尿道下裂的发生[1 ]。为探讨 SRD5A2 基因在尿道下

    裂发病中的作用 ,我们采用 PCR扩增直接测序的方

    法 ,对自2000 年 7 月至 2003 年 4 月 ,在我院尿道下

    裂治疗中心门诊、住院的全部尿道下裂患者中的 96

    例单纯尿道下裂患者进行了 SRD5A2 基因突变的

    检测。

    1 材料与方法

    111 标本来源

    11111 实验组 96 例同意进行 SRD5A2 基因检测

    研究的患者列为实验组 ,抽取抗凝外周静脉血 4～

    5 ml。

    11112 对照组 随机抽取2001年9月～2001 年 11

    月间在协和医院中心血站献血的健康男性献血员

    96人列为阳性对照组 ,健康女性献血员 30 人列为

    阴性对照组 ,收集抗凝的检验用血2～3 ml。

    112 PCR反应

    按常规方法提取患者外周血白细胞基因组

    DNA(酚P 氯仿抽提法) ,通过国际互联网 ,在美国国

    立图书馆数据库下载 SRD5A2 基因的全部外显子标

    准序列。将每个外显子向两端延伸 100～150 bp ,转

    换成纯文本文件 ,输入到引物设计软件 premier510

    中进行引物设计 ,其中第 1 外显子分成两部分设计

    引物 ,第5外显子分成5部分设计引物(表1) 。

    · 931 · 中华整形外科杂志2006年3月第22卷第2期 Chin J Plast Surg , Mar. 2006 Vol . 22 No. 2表1 PCR引物

    Tab 1 Primer used for PCR

    外显子 上游引物 下游引物

    1A tgagaaaggggtattgctgcg aggtggcccgaagagggag

    1B tgcaggttcagtgccagcagagc ttggcgttcctcggtgcgcg

    2 gaggtggggatgagaccatgttc gttttgcgatgggaaatggc

    3 ccctcctttcattttagcttagtttg ttcgtgccctcactgtccc

    4 ttcttgctgcctttgtgtattttg ttcggtttctcaatcttcctctgc

    5A taactgtaggttgacttgtaacaaag catgtacttggattgcccgg

    5B agtttactcctacccttccag aatagccataccagttttccg

    5C agaccttgaatacaggagccc ttttctgcccagacgtgcc

    5D tacagcagaagccccaagcaac gcattccgcaaacataggcc

    5E atacagagcccacatttccacacc tctttatttccagcacacagccc

    以50μl 反应体系 ,应用美国 Perkin Elmer 公司

    GeneAmp 2700 型 PCR 仪进行 96 孔板 PCR 扩增 ,采

    用美国 Millipore 公司生产的 Multiscreen2PCR plates

    96孔 PCR产物纯化板 ,利用其微孔过滤的分子筛作

    用机理 ,将 PCR产物中的各种离子、 dNTP、引物等小

    片段寡聚核苷酸筛除 ,从而实现目的片段的纯化 ......